羊口瘡病毒探針法熒光定量PCR檢測試劑盒

注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產物；9．PCR反應體系與反應條件。

儲存條件：

14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000 轉離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

探針法：
羊口瘡病毒探針法熒光定量PCR檢測試劑盒qMan 探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴增相關。它與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團連接在探針的5’ 末端，而淬滅劑則在3’ 末端。當完整的探針與目標序列配對時，熒光基團發射的熒光因與3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應時，聚合酶的5’ 外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基團與淬滅劑分離。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此熒光強度與擴增產物的數量呈正比關系。相對于染料法,Taqman探針法具有更高的特異性和準確性。
使用方法：
一、樣品DNA的制備
用自選方法提取細菌樣品DNA。注意：DNA純化方法是決定檢測靈敏度的關鍵因素。如果不能很好純化樣品DNA，后面的PCR再靈敏也不能提高整體檢測靈敏度。
二、制備O157:H7標準曲線（以10-10E6這6個10倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體病毒做陽性對照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的DN段作為陽性對照。
1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2和1號。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL超純水（用帶芯槍頭，下同）。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對照用TE緩沖液或超純水10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL（注：請不要將本試劑盒提供的標準品一次性稀釋至10E7拷貝/μL，建議每次稀釋10倍，梯度稀釋至10E7拷貝/μL）。
4. 在6號管中加入5 μL 10E7拷貝/μL的O157:H7陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得10E6拷貝/μL的陽性對照。
5. 換槍頭，從6號管中取5 μL溶液到5號管中，充分震蕩1分鐘，得10E5拷貝/μL的陽性對照。
6. 換槍頭，從5號管中取5 μL溶液到4號管中，重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。
7. NC管中不加任何陽性對照。
8. 從1-6號管中分別取5 μL和待測樣品一起進行定量PCR（見下步），每個樣品做3次重復。PCR后得到每個陽性對照稀釋樣品的熒光PCR Ct值，并以之為縱軸，以濃度的對數值為橫軸，繪制標準曲線。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

應用案例：
樣品 DNA 的制備
1.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費贈送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝（一管式病毒 DNAout 的成分）。
稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的長為 86bp 的 DN段作為陽性對照。
2.標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。5.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7.換槍頭，在 4 號管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中，得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用
8.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。設置 qPCR 反應（20  μL 體系，在樣品制備室進行）
9.在 PCR 管中加入下列成分。
以下是公司正在銷售的產品：

酞酰10 倍 TAE分子生物級濃縮緩沖溶液

五亞基二20 倍 SSPE分子生物級濃縮緩沖溶液

新戊酰10 倍 TPE分子生物級濃縮緩沖溶液

亞烯基二異硫氰酸胍

基稀酰胺

羊口瘡病毒探針法熒光定量PCR檢測試劑盒異基BCA（2，2‘－聯喹林－4，4’二酸二納）

異烯酰基十六基二基化胺（cetyldimethylethammonium bromide）

硬脂酰4－氨基－3－肼基－5巰基－1，2，4－三氮唑（AHMT）

月桂酰3－基－2－苯并噻唑腙鹽酸鹽（3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone；MBTH）

正戊基L－谷氨酰－α－萘酰胺（L－Glutamyl－α－naphthylamide）

L－谷氨酰對硝基苯胺一水（L－Glutamyl－p－Nitroanilide monohydrate）

二基二(十八基)季銨皂土谷胱甘肽（氧化型）（Glutathione；GSSH）

氟羅里硅土二苯基酰胺（diphenylformamide）

硅藻土721型分光光度儀1毫升1厘米光徑玻璃比色皿

膠狀黏土721型分光光度儀1毫升1厘米光徑塑料比色皿二十一醇磺酸酯(C21:0)二十一醇磺酸酯(C21:0),標準品，有證書 ,100mg/500mg/1gm

二十酰/花生酰(C20:0)二十酰/花生酰(C20:0),標準品，有證書 ,100mg/500mg/1gm/5gm/10gm/25gm

二十酸酯/花生酸酯(C20:0)二十酸酯/花生酸酯(C20:0),標準品，有證書 ,100mg/500mg/1gm/5gm/10gm

二十酸鈉/花生酸鈉(C20:0)二十酸鈉/花生酸鈉(C20:0),標準品，有證書 ,100mg/500mg/1gm

二十酸酯/花生酸酯1120-28-1二十酸酯/花生酸酯,標準品，有證書 ,100mg/500mg/1gm/5gm/10gm

二十酸甘油三酯/花生酸甘油三酯(C20:0)620-64-4二十酸甘油三酯/花生酸甘油三酯(C20:0),標準品，有證書 ,100mg/500mg/1gm

二十酸甘油二酯/花生酸甘油二酯(C20:0)60586-60-9二十酸甘油二酯/花生酸甘油二酯(C20:0),標準品，有證書 ,100mg/500mg/1gm

二十酸甘油單酯/花生酸甘油單酯(C20:0)二十酸甘油單酯/花生酸甘油單酯(C20:0),標準品，有證書 ,100mg/500mg/1gm

二十酸/花生酸(C20:0)506-30-9二十酸/花生酸(C20:0),標準品，有證書 ,100mg/500mg

二十碳烯酰(順-11)(C20:1)二十碳烯酰(順-11)(C20:1),標準品，有證書 ,100mg/500mg/1gm